ABSTRACT
Introducción: la resistencia antimalárica dificulta el control del paludismo en Colombia. La vigilancia molecular de mutaciones puntuales en blancos terapéuticos es fundamental en el estudio de la resistencia a los antimaláricos. Objetivo: identificar mutaciones puntuales en el gen de la dihidropteroato sintetasa de Plasmodium falciparum (pfdhps), asociadas con resistencia in vitro a sulfadoxina. Métodos: la fuente de ADN de Plasmodium falciparum consistió en láminas de gota gruesa de 55 individuos con infección malárica, reportados en el departamento de Bolívar, Colombia. El ADN se extrajo con solución de Chelex-100 al 5 %. Las mutaciones se identificaron mediante PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) y secuenciación. Resultados: 17 muestras (31 %) amplificaron un fragmento de 438 pb de pfdhps. La PCR-RFLP mostró frecuencia del genotipo mutante G-437 en 65 % de los amplificados, el mixto A/G-437 en 29 % y el silvestre A-437 en 6 %. Los alelos mutantes G-437, F-436 y el alelo silvestre K-540 se identificaron en todas las muestras secuenciadas. Conclusiones: este es el primer reporte de mutaciones puntuales en el gen dhps de Plasmodium falciparum en el departamento de Bolívar, Colombia, lo cual contribuye al conocimiento de la resistencia a los antimaláricos en el Caribe colombiano.
Introduction: antimalarial drug resistance hinders the control of malaria in Colombia. The molecular surveillance of point mutations in therapeutic targets is essential in the study of antimalarial drugs. Objective: to identify point mutations at dihydropteroate synthetase gene of Plasmodium falciparum (pfdhps) associated with sulfadoxine resistance. Methods: source of P. falciparum DNA was blood thick smears of 55 individuals with malaria infection, reported in Bolivar, Colombia. The DNA was extracted with 5 %. Chelex-100 solution. The mutations were identified by PCR-RFLP and sequencing. Results: seventeen samples (31 %) amplified a 438 bp fragment of pfdhps. The PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) showed a frequency of mutant genotype (G-437) in 65 % of amplicons, mixed genotype (A/G-437) in 29 % and wild genotype (A/G-437) in 6 %. The mutant alleles G-437, F-436 and the wild allele K-540 were identified in all sequenced samples. Conclusions: this is the first report of point mutations in the P. falciparum dhps gene in Bolivar, Colombia. This result contributes to the knowledge of antimalarial drug resistance in the Colombian Caribbean region.
ABSTRACT
En el presente trabajo se evalúa la técnica de SSCP (polimorfismo de conformación de cadena individual de ADN) para detectar mutaciones puntuales, tanto por su sensibilidad en la detección (alrededor 80% en condiciones ideales), como por su implementación fácil y económica. Se utilizaron como controles positivos y negativos, ADN de voluntarios caracterizados previamente para las mutaciones puntuales de 5 RFLPs mitocondriales. Para la optimización de la prueba fueron ensayadas concentraciones variables del tampón TBE (1X y 0,5X) y del glicerol (10%, 5% y 0) en geles de poliacrilamida. Cuatro de los 5 RFLPs fueron detectados en las condiciones utilizadas y pueden ser usados en estudios de rutina sin usar enzimas de restricción. Además, la técnica SSCP permitió determinar mutaciones desconocidas en un segmento de 394 nucleótidos de la región hipervariable (HVI) del ADNmt. Diferencias en correspondencia a los distintos haplotipos fueron detectados e incluso permitió discernir grupos dentro del mismo subtipo. La secuenciación de dos muestras del subtipo B1 con migración diferencial en SSCP, corroboró la existencia de siete nucleótidos distintos.
We evaluate the use of SSCP (single strand conformational polymorphism), a relatively easy and inexpensive technique for the detection of point mutations with a sensibility around 80% under ideal conditions. To test the technique, we used samples of volunteers whose DNA had been previously characterized for the presence or absence of 5 mitochondrial RFLPs. Optimization of the tests included variations in TBE (1X and 0,5X) and of glycerol concentration (10%, 5% and no glycerol) in polyacrylamide gels. Four out of five RFLPs were detected under the conditions used and could be applied routinely without using restriction enzymes. In addition, the SSCP technique allowed detection of unknown mutations in a 394 bp nucleotide segment of the hypervariable (HVI) region of mtDNA. Differences corresponding to different haplotypes were detected, helping to distinguish groups within the same subtype. Sequencing of two samples of subtype B1 with differential migration on SSCP gels, proved the existence in seven different nucleotides.